To Die, To Sleep, Maybe to Dream.

시간이 없는 관계로 무진장 간단히.

1) Plasmid DNA  분리

주요 중점목표
- 단백질과 잡핵산(RNA)외에도 유전체 DNA라는 까다로운 물건을 제거해야함

뭔수로?
- 플라스미드와 유전체 DNA를 비교하면 당근 유전체 DNA가 크다. 그점을 쓴다.(....)

Method 1 : Alkaline Lysis

첫번째 : SDS + NaOH를 통해 세포를 용해시킴. 이때 단백질이 분해되면서, DNA가 변성됨.
두번째 : 아세트산나트륨을 처리하여 중화. 크기가 작은 플라스미드 DNA는 이중가닥으로 재생되나, 크기가 큰 유전체 DNA는 제대로 복원되지 못하고 불규칙한 형태로 됨.
세번째 : 원심분리. 찌꺼기들은 크기가 크므로 하층에, 플라스미드는 상층에 위치함.
네번째 : 순수 플라스미드 정제. 에탄올이나 이소프로판올을 사용하면 된다.

Method 2 : Boiling

첫번째 : 세제와 박테리아를 넣고 끓인다. 유전체 DNA는 세포막에 붙어있게 되고, 플라스미드는 크기가 작은 관계로 이탈하게 된다.
두번째 : 원심분리하여 상층액을 뽑는다. 이후 과정은 위와 같다.

버뜨 이건 시간 오래 걸리고 순도높이기가 힘들기 때문에 잘 안씀.

Method 3 : Money

자주 거래하는 화공약품점을 통해서 플라스미드 추출 전용 Kit를 구매한다. 해당 Kit을 구매하면 대량의 샘플을 빠른 시간동안 처리할 수 있으며, 특히 노가다가 많이 줄어든다. -_-

하지만 정산을 할때마다 나가는 자금의 문제는 내가 알 바 아니다.(...)

2) 박테리아 유전체/동물세포 유전체 DNA 분리법

이건 남들 다 할줄 아니까 패스. -_-
(사실 이것도 Money를 써서 전용 Kit를 쓰면 금방이다 -_-;)

3) 식물세포 유전체 DNA분리법

식물은 어떤 방법을 쓰든 다음과 같은 방법은 필수다. 고로 아무나 할 수 없다. -_-

선행 Method (?!) : 분쇄

식물을 분석하려면 일단 잘게 분쇄해야한다. 니가 서던을 하던 노던을 하건 웨스턴을 하건 일단 잘게 부숴야한다. 안부수면? 당연히 추출이 안된다. 이건 동물이나 박테리아에서는 할 필요도 없고, 할 생각도 없는 과정이다. -_-

하지만 식물 조직은 대체적으로 부드럽기 때문에 쉽사리 분쇄가 안된다. 어설프게 분쇄기로 넣는다고 해서 원하는 만큼의 효율이 나오지 않는다. 최고의 효율을 가지려면? 막자사발로 아주 가루를 만들면 된다. 하지만 부드러우니 안갈린다. 그래서 액체질소를 쓴다.(...)

사실 액체질소로 냉각하는 방법은 여러 이점이 있는데, 가장 큰 이점은 DNA가 아닌 RNA추출에서 나온다. RNA는 상온에서는 금세 제 형태를 상실하거나 RNase에 의해 분해되기 때문에, -70도로 보관하는게 추천되며, -196도인 액체질소는 저 조건을 충분히 만족한다.(...)

버뜨, 샘플에 액체질소처리를 한 다음 막자사발로 아무리 갈아봐야 샘플 녹으면 끝이다. 그렇기 때문에 가장 좋은 방법은 샘플과 막자사발을 통채로 냉각시키는것(...)이다. 여러가지 꼼수가 있지만 이거만큼 확실한 방법은 없다. 대신 한여름에도 손이 시려운 경험은 피해갈 수 없을거다. 물론 보호장구는 확실히 해둬라. 안그러면 동상걸린다.

만약 지금 있는 실험실, 혹은 일하고 있는 연구소가 장비가 빠방하다면 분쇄장치가 있을거다. 하지만 잊지 말아라. 분쇄장치를 통째로 냉각하지 않는이상 결과물은 원하는 나오지 않는다. 극소수의 장비 빼고는 저거 택도 없으니 장비를 쓸 생각은 거의 포기하는게 좋다. -_-
(난 장비를 통째로 액체질소에 담그는 만행(?)으로 인시수를 절감시키는데 성공했다.(...))

Main Method : CTAB Method

식물세포가 다른 세포보다 어려운 이유는 여러가지가 있는데, 탄수화물(특히 셀룰로오스), 2차 대사물질, 핵산분해효소등이 다른 세포에 비해서 엄청나게 많이 존재하기 때문이다. 저들을 한번에 넉다운 시킬 필요가 있는데, 여기에 사용하는 물질이 바로 CTAB다. 뭔 약자인지는 검색해봐라. 다 나온다. -_-;

CTAB는 양이온 세제의 역할을 하는데, 문제는 이녀석이 저런 방해물질을 DNA와 분리시켜주는데, 그 방법이 결합이라는 점이다. 당연히 DNA도 고염의 조건에서 CTAB와 결합한다. -_-

이걸 해결하는 것은 Chloroform. 이후에는 원심분리기로 잘 분리하고, DNase를 잘 죽이면 된다. 단지, 여러 특성상 대량의 DNA를 추출하는건 힘들수밖에 없다. -_-

물론 여기에도 Method : Money가 있다. CTAB를 이용한 분리과정이 생략되는 마법의 Kit(?!)인데, 시간이 거의 절반 가까이 줄어든다. 더 자세한 이야기를 하면 특정회사를 옹호하게 되므로 패스. 하지만 저런 좋은 아이템이 있어도 식물분석에는 무조건 액체질소 써야한다. -_-

Posted by 단순한생각